师：同学们，今天我们复习人教版生物学选择性必修三第三章基因工程的第一节——重组 DNA 技术的基本工具。首先回顾基因工程的概念以及理论基础。基因工程指按照人们的愿望，通过转基因等技术赋予生物新遗传特性，创造出更符合需求的新生物类型和生物产品。从技术操作层面看，基因工程是在 DNA 分子水平上设计和施工的，所以又叫做 DNA 重组技术，实现了跨物种的基因交流。
那为什么不同生物的 DNA 分子能拼接起来？一种生物的基因为何能在另一种生物细胞内表达呢？我们知道，DNA 的基本单位都是脱氧核苷酸，空间结构都是双螺旋，碱基配对方式也相同，这是不同生物 DNA 能拼接的基础。而基因控制蛋白质合成且生物共用一套遗传密码，是转移后的基因能在新细胞中表达的基础。
从 DNA 是遗传物质的理论发现，到 DNA 双螺旋结构提出，再到遗传密码破译，都为基因工程奠定了基础。生物化学、分子生物学和微生物学等基础理论的发展，催生了基因工程相关技术。我们以番木瓜华农 1 号的培育为例，回顾基因工程相关知识。
番木瓜是岭南四大家果之一，但生长受单链 RNA 病毒——环斑病毒威胁，严重时会导致番木瓜减产 80% - 90%。华南农业大学利用转基因技术，将环斑病毒的复制酶基因转入番木瓜植株，获得优质抗病毒番木瓜——华农 1 号。该品种能抵抗华南地区现已发现的 5 种病毒株系。自 2006 年获得生产应用安全证书以来，已在华南地区广泛种植，这也是我国首例转基因果树被批准商品化生产，带来良好经济、社会和环境收益。
这里是番木瓜华农 1 号的培育过程，请根据已学知识简要描述华农一号培育的主要步骤，以及每个步骤所需工具。在这个过程中至少涉及三个关键步骤：第一步是获取目的基因，环斑病毒是 RNA 病毒，无法将其体内基因与质粒直接相连，必须先经过逆转录获得相应 DNA，这段 DNA 才是可拼接的目的基因，然后对目的基因进行切割，必要时还要改造。
第二步，将目的基因与质粒拼接。第三步，将拼接产生的重组质粒导入受体细胞。我们把每个步骤所需工具形象地称为分子手术刀、分子缝合针和分子运输车。要对直径仅两纳米的 DNA 分子操作，人为设计工具几乎不可能。
那科学家们如何找到这些分子工具的呢？著名美国生物学家威尔逊说过，每个生物科学问题的答案都必须在细胞中寻找。1944 年，艾弗里通过肺炎双球菌转化实验，不仅证明 DNA 是遗传物质，还证明 DNA 可在微生物不同个体间转移，那么微生物细胞中大概率本身就存在这些分子工具。所以科学家们致力于深入研究微生物细胞。果不其然，1967 年到 20 世纪 70 年代间，科学家们陆续发现了这些分子工具。下面对这些工具的知识点进行归纳整理。
切割 DNA 分子的工具是限制性内切核酸酶，又称限制酶，主要从原核生物中分离纯化出来，至今已有数千种。它们能专一识别双链 DNA 分子特定核苷酸序列，并在每条链特定部位切开磷酸二酯键，达到切割 DNA 分子的作用。
思考两个问题：第一，限制酶在原核生物中有什么作用？第二，为什么限制酶不切细菌本身的 DNA？原核生物作为单细胞生物，易吸收外源 DNA 分子，其体内限制酶主要切割这些外源 DNA，保护自身。
那为什么限制酶不剪切细菌本身的 DNA 呢？有两个可能原因：一是其 DNA 分子不具备这种限制酶的识别序列；二是它通过甲基化使限制酶不能切开自身 DNA。大多数限制酶识别序列由 6 个核苷酸组成，如果限制酶切割部位位于序列中轴线，切割后形成的末端叫平末端；如果切割部位位于中轴线两侧，切割出的末端叫黏性末端。所谓黏性，就是这种末端有未配对碱基，遇到相同黏性末端，未配对碱基能通过氢键相连，这种吸引力就好像产生了黏性。
下面做几个练习，请准备好纸和笔。
一、写出下列限制酶切割形成的黏性末端。来看答案，写对了吗？这里要注意，不同限制酶也可能产生相同黏性末端，这类酶叫同尾酶。同尾酶的存在使切割位点可选择范围更大。
练习二，请判断以下黏性末端由几种限制酶作用产生，答案是三种。解题思路是，先写出黏性末端配对碱基，找到切割位点，再补全识别序列。以第一个为例演示，先写出黏性末端配对碱基，可见切割位点在 a 和 g 之间。在上面一条链补出 g，下面一条链补出 c，这个就是该酶的识别序列，其他两个请自己试试。
回到番木瓜华农 1 号的培育，这里有三种限制酶切割位点，目的基因片段上没有限制酶切割位点。要让两者拼接，就需对目的基因改造，即在抗 PRSV 基因两侧添加酶切位点。
基因工程第二个分子工具是 DNA 连接酶，作用是连接两个切割后的 DNA 片段，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。DNA 连接酶有两种，简单比较一下。从名字可知，EcoRI DNA 连接酶来自大肠杆菌，只能连接黏性末端。T4 DNA 连接酶来自 T4 噬菌体，既能连接黏性末端，也能连接平末端，但连接平末端效率稍低。
那么 DNA 连接酶和 DNA 聚合酶是一回事吗？看演示。这里两段 DNA 片段，通过氢键，黏性末端互补配对，然后由 DNA 连接酶连接，恢复磷酸二酯键。再看 DNA 聚合酶作用，是将单个脱氧核苷酸连接成一条长链。
通过演示发现，DNA 聚合酶连接单个脱氧核苷酸成链，还需一条链作模板，将单个核苷酸连接到已有 DNA 片段上需要引物；而 DNA 连接酶连接的是两个 DNA 双链片段。DNA 复制过程中，两种酶都参与，但基因工程中参与的是 DNA 连接酶。
目的基因的运输车一般是质粒，也有噬菌体和动植物病毒，作用是将目的基因送入受体细胞。为什么目的基因需要运输车呢？因为目的基因作为外源 DNA 分子，很难直接进入细胞，即便进入也易被分解清除，不能稳定存在。所以要找运输车，将目的基因送入受体细胞，并确保其稳定存在和表达。
质粒就是天然优良载体，此外，噬菌体和动植物病毒因能侵染细胞的特性，也可作为基因载体。目前最常用的还是质粒，重点复习质粒功能。质粒是裸露、结构简单的环状双链 DNA 分子，一般独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核以外存在。质粒有一个或多个限制酶切割位点，自身可在细胞中复制或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 复制。
除这两个特点外，质粒作为基因载体还需具备什么特点呢？为筛选出重组 DNA 分子，一般质粒上要有特殊标记基因，且质粒对受体细胞应无害，还容易分离。天然质粒一般很难同时具备这些特点，但经人工改造可成为合格载体。